Не так давно мы сообщали о том, что коллектив авторов из сектора Молекулярной генетики клетки ЛЯП ОИЯИ в составе А. Е. Ивановой (инженер), А. Н. Русаковича (инженер) и Е. В. Кравченко (начальник сектора) получил патент в области молекулярной биологии и медицины. Изобретение обеспечивает расширение числа способов прогнозирования развития заболеваний, связанных с уровнем иммуноглобулина Е (IgE) в сыворотке крови человека.

О работе коллектива, проделанной под руководством Елены Владимировны Кравченко, рассказала молодой ученый СМГК ЛЯП Анастасия Иванова.

В современном мире все большее значение приобретает исследование генетической информации, что привело к возникновению нового подхода к диагностике и лечению различных заболеваний в персонализированной медицине. Развитие технологий в виде секвенирования следующего поколения (NGS) и ДНК-микрочипов позволили существенно снизить временные затраты на изучение геномной информации. Тем не менее, их использование для рутинной лабораторной диагностики маловероятно из-за высокой стоимости оборудования и расходных материалов, больших временных затрат, повышенного риска загрязнения образцов и требуемой высокой квалификации исследователей. Эти ограничения можно обойти при помощи метода TaqMan. Его специфика позволяет разработать точные и недорогие системы индивидуального прогнозирования развития заболеваний, связанных с различными SNP (SNP — Single nucleotide polymorphism — однонуклеотидный полиморфизм). Такие системы не требуют высокой квалификации исследователя для проведения реакций или дорогого оборудования и расходных материалов, а их результаты — дополнительной обработки.

Рис. 1. Принцип работы TaqMan® анализа (https://www.thermofisher.com/ru/ru/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-learning-center/real-time-pcr-basics/how-taqman-assays-work.html с модификациями авторов)

Одна из актуальных проблем нашего времени — аллергические заболевания. Статистика показывает, что они занимают одно из первых мест в структуре заболеваемости во всех возрастных группах. Учитывая это, важно уделить особое внимание методам диагностики предрасположенности к ним, в том числе и на доклиническом этапе, что позволит организовать раннюю профилактику и контроль специалистов в группах с высоким риском их развития. На сегодняшний день для оценки риска развития аллергических заболеваний в основном используют сбор семейного анамнеза. Недостаток этого метода связан с его субъективностью. Разработанная нами система комплексного анализа генетических полиморфизмов, связанных с аллергическими заболеваниями позволит расширить число доступных методов и повысить точность оценки риска их развития.

В ходе исследований развития аллергических реакций, связанных с I-типом гиперчувствительности, был открыт иммуноглобулин E (IgE). При таком типе гиперчувствительности, также называемом анафилактическим, возникает каскад реакций, происходящих благодаря синтезу плазмацитами специфического IgE после поступления первичного аллергена, что в конечном счете приводит к клиническим проявлениям аллергии. С эволюционной точки зрения ключевой ролью IgE является защита организма от паразитов, представлявших серьезные риски для выживания человека в дикой природе. Однако, с развитием цивилизации распространённость паразитарных инфекций снизилась, а высокий уровень сывороточного IgE сохранился, благодаря чему контакты с аллергенами стали приводить к развитию патологических реакций. Позже в исследованиях была отмечена корреляция между уровнем IgE в сыворотке крови и некоторыми заболеваниями. При высоких уровнях сывороточного IgE возрастает вероятность развития таких заболеваний, как атопический дерматит, хроническая крапивница, астма, аллергический ринит, аллергический риноконъюнктивит. И наоборот, склонность к паразитарным заболеваниям и токсинам животного происхождения связывают с пониженным уровнем сывороточного IgE. Зная это, можно утверждать, что высокий уровень сывороточного IgE является маркером некоторых аллергических заболеваний, а низкие сывороточные уровни IgE являются одной из причин пониженной устойчивости к паразитарным заболеваниям и токсинам животного происхождения.

Перед нами стояла задача разработать систему из TaqMan зондов и праймеров для анализа человеческих полиморфизмов rs2251746 и rs2427837 методом аллельной дискриминации. rs2251746 и rs2427837 — это однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) в гене, кодирующем альфа-цепь высокоаффинного рецептора IgE (FCER1A) на хромосоме 1q23. Различные исследования показали высокий уровень корреляции между присутствием в геноме человека rs2251746 или rs2427837 и уровнем IgE в сыворотке крови, а также вероятностью развития аллергических реакций. Эта система позволяет оценить риск возникновения заболеваний человека, связанных с уровнем IgE в сыворотке крови, такими как атопический дерматит, хроническая крапивница, атопическая экзема, астма, аллергический ринит, аллергический конъюнктивит и аллергический риноконъюнктивит.

TaqMan анализ широко используется в аллельной дискриминации, благодаря его чувствительности и специфичности.

Зонд TaqMan представляет собой аллель-специфический олигонуклеотидный зонд, меченный флуоресцентным красителем на 5’ конце и гасителем на 3’ конце.

Метод основан на 5’ — 3’ — экзонуклеазной активности Taq ДНК-полимеразы, позволяющей расщеплять 5’-концевые нуклеотиды двухцепочечной ДНК, высвобождая моно- и олигонуклеотиды.

Когда зонд не полностью комплементарен ДНК, он не расщепляется Taq-полимеразой, а открепляется от нуклеотидной последовательности целиком, а потому флуоресценция, излучаемая флуоресцентным красителем на 5’ конце, полностью поглощается гасителем на 3’ конце зонда из-за передачи энергии флуоресцентного резонанса (FRET).

В случае, если зонд полностью комплементарен ДНК, он расщепляется Taq-полимеразой, зонд разрушается, а флуоресцентный краситель и гаситель выходят в раствор, и, поскольку они больше не связаны, эффект гасителя исчезает и флуоресценцию, издаваемую флуорофором можно обнаружить Real-Time амплификатором. Интенсивность флуоресценции в таком случае будет пропорциональна количеству продуктов ПЦР.

Аллельная дискриминация — это мультиплексный (больше 1 праймер/зонд пар на реакцию), end-point (считывание данных происходит в конце ПЦР процесса) метод, который используется для обнаружения различий между генотипами, мутациями и полиморфизмами путем сравнения флуоресценции, полученной с использованием меченных красителем зондов. Использование двух пар праймеров и зондов в каждой реакционной смеси позволяет произвести генотипирование 2 возможных вариантов одного SNP в целевой последовательности. При этом фактическое количество продукта ПЦР не определяется, что делает аллельную дискриминацию качественным анализом.

Для каждого варианта аллели используются свои красители, с тем условием, чтобы свечение этих красителей не пересекалось.

Генотипирование осуществлялось по величине RFU (относительных единиц флуоресценции). Для rs2251746 зонд с флуоресцентным красителем FAM соответствует аллелю T, зонд с красителем ROX – аллелю С. Для rs2427837 зонд с флуоресцентным красителем FAM соответствует аллелю A, зонд с красителем ROX – аллелю G. Оценка генотипа для каждого из образцов не составляет труда, поскольку на полученных графиках видно четкое разделение исследуемых образцов на три кластера: гомозиготы GG/CC, гетерозиготы AG/CT, гомозиготы AA/TT.

Рис. 2. Аллельная дискриминация методом детекции TaqMan зондов по данным величин RFU каждого зонда на амплификаторе CFX96 c детектирующей системой в режиме реального времени полиморфизма rs2251746: ♦ — отрицательный контроль, ■ — гомозиготы CC, ▲ — гетерозиготы CT, ● — гомозиготы TT.

Рис. 3. Аллельная дискриминация методом детекции TaqMan зондов по данным величин RFU каждого зонда на амплификаторе CFX96 c детектирующей системой в режиме реального времени полиморфизма rs2427837: ♦ — отрицательный контроль, ■ — гомозиготы GG, ▲ — гетерозиготы AG, ● — гомозиготы AA.

Для интерпретации результатов можно воспользоваться следующей таблицей:

rs2427837 rs2251746	GG	AG	AA
TT	высокий	повышенный	средний
CT	повышенный	средний	пониженный
CC	средний	пониженный	низкий

Все полученные нами результаты были подтверждены секвенированием.

Этот метод обладает следующими преимуществами:

1. Позволяет охватить широкий спектр IgE зависимых заболеваний,
2. Является точным, простым, быстрым и недорогим в исполнении,
3. Не требует медицинских знаний, сбора анамнеза или присутствия пациента,
4. Может быть проведен с использованием различных видов биологического материала, содержащих ДНК пациента (венозная кровь, буккальный эпителий, волосяные фолликулы и др.),
5. Может использоваться для любой группы населения,
6. Позволяет оценить вероятность передачи данного признака потомкам,
7. Результат исследования не зависит от образа жизни и состояния здоровья пациента.

Как продолжение этого направления работ в Секторе молекулярной генетики клетки ЛЯП разработана и протестирована система TaqMan-зондов и праймеров, позволяющих идентифицировать наследуемые варианты одного из важных генов, определяющих склонность к долголетию человека, — гена FOXO3A.

Анастасия Иванова, инженер, сектор Молекулярной генетики клетки ЛЯП