Сотрудники Лаборатории радиационной биологии ОИЯИ разработали принципиально новый метод усиления биологической эффективности пучков протонов медицинского назначения и гамма-терапевтических установок. Хорошо известный в медицине препарат для химиотерапии лейкозов 1-β-D-арабинофуранозилцитозин в комбинации с протонным облучением оказался способен подавлять процесс развития меланомы у мышей. Продолжаются дальнейшие исследования, которые могут привести к использованию этого способа в терапии онкологических заболеваний.

Основным методом лечения меланомы, особенно на начальных этапах развития заболевания, является хирургическое иссечение опухоли. Однако во многих случаях используются и другие методы: таргетные иммунопрепараты, лучевая терапия. При этом меланома является одной из самых радиорезистентных форм злокачественных новообразований. Именно поэтому ученые ищут радиомодификаторы, которые сделали бы более эффективным облучение этого вида рака.

Научный руководитель Лаборатории радиационной биологии ОИЯИ член-корр. РАН Евгений Красавин рассказал предысторию исследований: «Новый метод продолжает исследования, начатые много лет назад в Лаборатории. Общеизвестно, что во время облучения в клетках опухоли возникают повреждения ДНК, которые могут быть однонитевыми – потенциально восстановимыми – или двунитевыми, приводящими клетки к гибели. Наши специалисты показали, что в условиях влияния арабинозидцитозина при облучении протонами клеточных культур in vitro повышается частота образования летальных разрывов ДНК в клетках человека».

Научный руководитель ЛРБ ОИЯИ Евгений Красавин

В 2019 году группа ученых ЛРБ ОИЯИ описала принципиально новое применение препарата, используемого в химиотерапии лейкозов, 1-β-D-арабинофуранозилцитозина (арабинозидцитозина, АраЦ; химическое название 4-Амино-1-бета-В-арабинофуранозил-2(1Н)-пиримидинон). АраЦ встраивается в концевое звено молекулы ДНК во время репарации – восстановления исходной последовательности ДНК, что ведет к нарушению восстановительных процессов. Ингибитор АраЦ блокирует активность ДНК-полимераз α и β, принимающих участие в синтезе ДНК во время репарации, в результате чего происходит фиксация однонитевых разрывов ДНК. Более того, при попытке репарации однонитевых разрывов в присутствии АраЦ образуются двунитевые повреждения ДНК. Было установлено, что АраЦ – это особый радиосенсибилизатор, который преобразует однонитевые разрывы ДНК в двунитевые при попытке клетки репарировать это повреждение. Этим он выделяется среди других препаратов – ингибиторов репарации ДНК. По результатам этих исследований уже получен патент ОИЯИ на изобретение № 2699670 авторства Е. А. Красавина и других.

Заведующая отделом радиационной биохимии МРНЦ им. А. Ф. Цыба – филиала НМИЦ радиологии Минздрава России, ведущий научный сотрудник Отдела радиационной биологии и физиологии ЛРБ ОИЯИ, профессор Ирина Замулаева

Исследования на различных типах нормальных и опухолевых клеточных культур крайне важно было продолжить на экспериментальных животных. Такие исследования были выполнены в Обнинске под руководством заведующей отделом радиационной биохимии Медицинского радиологического научного центра им. А.Ф. Цыба – филиала Национального медицинского исследовательского центра радиологии Минздрава России, ведущего научного сотрудника ЛРБ ОИЯИ, профессора Ирины Замулаевой. Она пояснила, что действие АраЦ можно сравнить с троянским конем. Введенный перед облучением в кровь, арабинозидцитозин внедряется в ДНК опухолевых клеток. Если возникают однонитевые повреждения ДНК в ходе облучения, при попытке их репарации они преобразуются в двунитевые повреждения. Важно заметить, что в ходе облучения однонитевых повреждений возникает в десять раз больше, чем двунитевых. К тому же, дальнейшие исследования показали, что эффект АраЦ не ограничивается одним днем – он пролонгированный.

В 2021 году были предприняты первые эксперименты по облучению протонами в условиях влияния АраЦ привитой экспериментальным животным (мыши) опухоли меланомы. 90 подопытных животных с привитыми в заднюю лапу клетками меланомы были разделены на четыре группы: контрольная – не проходившая курс лечения, «АраЦ» – получившая только химиотерапию арабинцитозином, «Протоны» – только облученные животные и «АраЦ + Протоны», на которой был опробован комбинированный метод лечения.

АраЦ вводили в хвостовую вену мышей в концентрации 125 мг/кг на 12 сутки после трансплантации опухолевых клеток. Через час после введения АраЦ животным из четвертой группы однократно облучали опухоль пучком протонов в дозе 10 Гр. Облучение проводилось в МРНЦ им. А. Ф. Цыба на комплексе «Прометеус» – первом российском комплексе протонной терапии, сертифицированном для клинического использования. Продолжительность сеанса облучения составляла 4 минуты. Чтобы попасть точно в глубину залегания опухоли, специалисты использовали так называемый пик Брэгга – эффект резкого выделения большей части энергии заряженных частиц в конце их пробега. Чтобы создать модифицированный пик Брэгга точно в месте расположения опухоли, облучение проводили через слой полиметилметакрилата толщиной 8 мм. Каждые два-три дня, начиная с момента облучения, отслеживали изменение размеров опухолевых очагов, вычисляя для каждой опухоли средний диаметр и объем.

Исследование показало, что при комбинированном действии АраЦ и протонного излучения происходит уменьшение количества опухолевых клеток, опухоль становится более чувствительной к действию радиации, но особенно важным является то, что при этом снимается радиорезистентность опухолевых стволовых клеток (ОСК). ОСК – это сравнительно небольшая популяция клеток, из которой формируются новые клетки злокачественного новообразования, ответственная за поддержание его существования и разрастания. По многим признакам ОСК очень похожи на обычные стволовые клетки. Например, они так же обладают свойством «эвакуировать» из себя различные красители и химиопрепараты, вследствие чего имеют более высокую резистентность ко многим противоопухолевым препаратам по сравнению с основной массой не стволовых клеток. ОСК исследуются во всем мире на протяжении вот уже более чем двадцати лет. Их инактивация – важнейшая задача в ходе лечения. Было выяснено, что арабинозидцитозин крайне эффективно воздействует и на этот тип клеток, что открывает новые перспективы в лечении меланомы.

Изменение размеров первичного очага меланомы В16 в разные сроки после одиночного и комбинированного действия АраЦ (125 мг/кг) и протонного излучения в дозе 10 Гр

«Опухолевые стволовые клетки обладают повышенной резистентностью к ионизирующему излучению и противоопухолевым препаратам. Они могут сохраняться в ткани опухоли после традиционных методов лечения. К сожалению, стандартного метода, чтобы их инактивировать и удалить из опухоли, до сих пор не существует. А вот если использовать ингибитор репарации повреждений ДНК, такой как АраЦ, то «снимается» их резистентность, и они гибнут точно так же, как не стволовые», — прокомментировала Ирина Замулаева.

После комбинированного воздействия доля ОСК в опухолях была снижена в 3,1 раза по сравнению с однократным облучением. Стволовые клетки были идентифицированы по своей способности «эвакуировать» во внешнюю среду флуоресцентный липофильный краситель и формировать так называемую боковую популяцию слабо окрашенных клеток, выявляемую с помощью проточной цитометрии.

Торможение роста опухолей по сравнению с контролем, в особенности начиная с девятых суток после проведения облучения, наблюдалось в двух группах: «АраЦ + Протоны» и «Протоны». Одиночное же введение АраЦ не оказывало влияния на рост опухолей. При этом, начиная с 18-х суток, комбинированный метод демонстрировал значительно более высокую эффективность: различия в среднем объеме опухолей между группами достигали 1,7 – 2,0 раз, то есть торможение роста опухолей в группе «АраЦ + Протоны» по сравнению с группой «Протоны» составляло 37 – 51 %.

Доля ОСК в первичном очаге меланомы линии В16 через 2 суток (белые колонки) и 9 суток (серые колонки) после облучения протонами и комбинированного воздействия АраЦ и протонов. *р=0,003 по сравнению с группой «Протоны»

Молекулярно-клеточные показатели клеточной гибели и пролиферации, т. е. процессов, баланс которых определяет радиационные изменения в размере опухолей, в группах «АраЦ + Протоны» и «Протоны» примерно соответствовали друг другу. «Изменения молекулярно-клеточных показателей гибели и пролиферации клеток ассоциированы с торможением роста опухолей после облучения протонами или комбинированного воздействия по сравнению с контролем, но не могут объяснить эффект наибольшего торможения роста опухолей в группе «АраЦ + Протоны». Единственное объяснение этого эффекта, обнаруженное в работе, связано со снижением пула ОСК именно после комбинированного воздействия», — говорится в статье, опубликованной по итогам исследования в выпуске № 1 «Писем в ЭЧАЯ» за 2023 год «Радиобиологическое влияние комбинированного действия 1-β-D-арабинофуранозилцитозина и протонного излучения на меланому линии В16 in vivo» (авторы – И. А. Замулаева, О. Н. Матчук, Е. И. Селиванова, А. О. Якимова, В. А. Мосина, С. Н. Корякин, А. Д. Каприн, А. В. Борейко, А. Н. Бугай, В. Н. Чаусов, Е. А. Красавин).

Влияние АраЦ изучалось применительно именно к протонному облучению не случайно. Дозное распределение таких видов ионизирующих излучений, как гамма-, рентгеновское, пучка электронов не является оптимальным при терапии опухолевых образований, в отличие от пучка положительно заряженных частиц. Пучки протонов обеспечивают конформный характер облучения опухолевой ткани: максимальное облучение мишени – опухоли, и минимальное облучение прилегающих здоровых тканей, пояснила Ирина Замулаева.

По итогам исследования в июне 2022 года сотрудники Центра им. А.Ф. Цыба и ЛРБ ОИЯИ получили патент на изобретение № 2774032 «Способ повышения эффективности действия ионизирующих излучений на меланому». «Этот патент касается однократного облучения в дозе 10 Гр, однако при лечении больных речь идет о нескольких сеансах, поскольку дать большую разовую дозу пациенту нельзя. Поэтому делают так называемое фракционированное облучение. Обычная доза на фракцию, на сеанс облучения, составляет около 2 Гр», — отметила Ирина Замулаева. В настоящее время группа исследователей моделирует клиническую ситуацию, завершая курс фракционированного облучения in vivo.